Determination of 9 Organic Acids in Tobacco Flavors by Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Composite Linear Ion Trap Mass Spectrometry
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摘要:
采用液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法定性定量检测烟用香精香料中苹果酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、己二酸、乙酰丙酸等9种有机酸。取0.1 g烟用香精香料样品,加入20 mL水,超声提取10 min。取上清液1 mL,过0.22 μm水相滤膜后用水稀释10倍,按照优化的仪器工作条件测定。在Synergi Hydro-RP色谱柱上用不同体积比的0.1%（体积分数,下同）甲酸溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液的混合液梯度洗脱分离各有机酸后,用电喷雾离子源负离子模式电离,多反应监测-信息依赖采集-增强子离子（MRM-IDA-EPI）模式扫描,MRM模式定量,保留时间结合EPI标准品二级质谱库定性。结果表明：9种有机酸的质量浓度均在一定范围内和定量子离子峰面积呈线性关系,检出限（3s/k）为0.003~0.018 mg·L−1；对实际样品进行加标回收试验,回收率为73.3%~112%,日内（n=6）、日间（n=5）精密度试验所得测定值的相对标准偏差分别不大于10%和不大于15%；方法用于142种烟用香精香料样品的分析,检出率较高的4种有机酸为乳酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸。
Abstract:The 9 organic acids, including malic acid, citric acid, lactic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, tartaric acid, adipic acid and levulinic acid, in tobacco flavor samples were determined qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-triple quadrupole composite linear ion trap mass spectrometry. The 0.1 g of tobacco flavor sample was taken, and 20 mL of water was added. After extracting by ultrasound for 10 min, 1 mL of the supernatant was taken, and passed through a 0.22 μm aqueous phase membrane. The solution obtained was diluted 10 times with water for determination according to the optimized instrument operating conditions. Organic acids were separated by gradient elution with mixed solutions of 0.1% (volume fraction, the same below) formic acid solution and methanol solution containing 0.1% formic acid at different volume ratios on the Synergi Hydro-RP chromatographic column, ionized by negative ion mode of electrospray ion source, scanned by the multiple reaction monitoring-information dependent acquisition-enhanced product ion (MRM-IDA-EPI) mode, quantified by MRM mode, and qualitatively analyzed by combining EPI standard secondary mass spectrometry library with retention time. It was shown that linear relationships between values of the mass concentrations of 9 organic acids and peak areas of quantitative daughter ions were kept in definite ranges, with detection limits (3s/k) in the range of 0.003-0.018 mg·L−1. Test for recovery was conducted on actual samples by the standard addition method, with recoveries ranging from 73.3% to 112%. RSDs of the determined values obtained from intra-day (n=6) and inter-day (n=5) precision tests were not exceed 10% or 15%, respectively. The proposed method was applied to the analysis of 142 tobacco flavor samples, and 4 organic acids with the higher detection rates were lactic acid, malic acid, succinic acid and citric acid.
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有机酸是烟用香精香料的重要成分,研究表明苹果酸、柠檬酸等多元酸在烟用香精香料中含量较高[1-2]。虽然多元酸对香料的香味没有明显作用,但经加香加料工艺添加到卷烟烟丝中时具有平衡烟气酸碱度、增加烟气浓度水平的效果,进而提高烟气舒适性、改善吃味品质[3-5]。因此,准确分析烟用香精香料中有机酸的种类和含量,对烟用香料品质控制及指导香精香料调配具有重要作用。
目前,烟用香精香料、烟草及烟草制品中有机酸的测定方法主要有离子色谱法[2,6]、气相色谱法（GC）[7-8]、气相色谱-质谱联用法[1,9-10]、高效液相色谱法（HPLC）[11-13]、液相色谱-质谱联用法[14-16]等。其中：GC及气相色谱-质谱联用法一般需要对有机酸样品甲酯化衍生后进行测定,如行业标准YC/T 288—2009《烟草及烟草制品 多元酸(草酸、苹果酸和柠檬酸)的测定 气相色谱法》利用硫酸甲醇对烟草中的有机酸甲酯化后进行GC测定,方法前处理较复杂、测定下限偏高,仅实现了3种有机酸的有效测定；离子色谱法运行时间偏长、定性能力稍差；液相色谱-质谱联用法可实现有机酸样品的快速定量分析,但琥珀酸、马来酸等目标物缺少定性离子对信息[15]。鉴于此,本工作提出了超声辅助萃取-液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法测定烟用香精香料中9种有机酸含量的方法,方法利用多反应监测（MRM）模式进行定量,保留时间结合有机酸标准品的二级质谱库进行定性,实现了9种有机酸的同时定性定量分析,旨在为烟用香精香料中有机酸的研究提供参考。
1. 试验部分
1.1 仪器与试剂
QTRAP 5500型三重四极杆复合线性离子阱质谱仪；Agilent 1260型液相色谱仪；Milli-Q型超纯水仪；XP205型电子天平（感量0.000 1g）；KQ-800型超声波清洗器；4-16K型离心机。
单标准储备溶液：约200 mg·L−1,分别准确称取9种有机酸标准品各20 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL,摇匀备用。
混合标准中间液：约10 mg·L−1,分别移取0.5 mL单标准储备溶液至10 mL容量瓶中,用水稀释,摇匀备用。
DL-苹果酸、丙二酸、马来酸标准品的纯度不小于99%；柠檬酸、L-酒石酸、己二酸标准品的纯度不小于99.5%；L-乳酸标准品的纯度为88.8%；乙酰丙酸标准品的纯度不小于97.5%；琥珀酸标准品的纯度为96.5%；甲醇为色谱纯；试验用水为Milli-Q型超纯水仪制备的去离子水,电阻率不小于18.2 MΩ·cm。
142种市售烟用香精香料样品,由浙江中烟工业有限责任公司提供。
1.2 仪器工作条件
1）色谱条件 Synergi Hydro-RP色谱柱（250 mm×4.6 mm,4 μm）；柱温30 ℃；流动相A为0.1%（体积分数,下同）甲酸溶液,B为含0.1%甲酸的甲醇溶液,流量0.5 mL·min−1；进样量2 μL。梯度洗脱程序：0~3.0 min,A为95%；3.0~13.0 min,A由95%降至5%,保持2.0 min；15.0~15.5 min,A由5%升至95%,保持4.5 min。
2）质谱条件 电喷雾离子（ESI）源,负离子（ESI−）模式；离子源温度500 ℃；喷雾电压−4 500 V；雾化气压力414 kPa,气帘气压力241 kPa,辅助加热气压力414 kPa；碰撞气浓度模式为高；多反应监测-信息依赖采集-增强子离子（MRM-IDA-EPI）扫描方式。其他质谱参数见表1。
表 1 质谱参数Table 1. MS parameters序号 有机酸 保留时间/min 母离子质荷比（m/z） 定量子离子m/z 去簇电压/V 碰撞能量/eV 1 酒石酸 5.46 148.3 86.9 -30 -16 2 苹果酸 6.52 132.8 114.9 -30 -15 3 丙二酸 6.90 102.8 58.9 -40 -14 4 乳酸 7.97 88.9 43.0 -40 -14 5 马来酸 8.95 114.8 70.9 -40 -14 6 柠檬酸 9.82 190.8 110.9 -35 -18 7 琥珀酸 11.71 116.8 72.9 -25 -14 8 乙酰丙酸 13.29 114.8 96.9 -30 -12 9 己二酸 15.08 144.9 82.9 -40 -16 1.3 试验方法
准确称取0.1 g烟用香精香料样品于50 mL锥形瓶中,加入20 mL水,超声提取10 min；取上清液1 mL,过0.22 μm水相滤膜后用水稀释10倍,按照仪器工作条件分析。在实际检测中,根据样品中有机酸的含量调整样品量或稀释倍数,使上机溶液中有机酸含量在标准曲线的线性范围内。
2. 结果与讨论
2.1 有机酸的EPI二级质谱图
用水稀释配制1 mg·L−1的单标准溶液,针泵进样,在ESI−模式下进行一级质谱扫描,母离子均为[M-H]−,进一步进行子离子扫描,选择响应较强的子离子为定量离子,并优化去簇电压和碰撞能量,详细参数见表1。
按照仪器工作条件测定单标准溶液,得到的9种有机酸的EPI二级质谱图见图1。
2.2 色谱柱的选择
在流动相中添加一定比例的甲酸,可以抑制有机酸的电离,使其以分子态的形式在色谱柱上保留并得到进一步分离[11,17],因此试验以0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇溶液体系为流动相,比较了9种有机酸在SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）和Synergi Hydro-RP色谱柱（250 mm×4.6 mm,4 μm）上的分离效果,结果见图2。
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图 2 9种有机酸在不同色谱柱上的总离子流色谱图Figure 2. Total ion chromatograms of 9 organic acids on the different chromatographic columns由图2可知：SB-C18色谱柱属于常规C18色谱柱,苹果酸、柠檬酸等峰展宽较大,且马来酸与柠檬酸未完全分离；Synergi Hydro-RP色谱柱属于极性端封尾的改性C18色谱柱,对高极性化合物有强保留,9种有机酸在该色谱柱上峰形对称、分离度高。因此,试验选择采用Synergi Hydro-RP色谱柱（250 mm×4.6 mm,4 μm）分离9种有机酸。
2.3 前处理条件的选择
2.3.1 萃取溶剂
试验考察了分别以甲醇和水为萃取溶剂时烟用香精香料样品中各有机酸的测定结果,如图3所示。
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图 3 不同萃取溶剂下有机酸的测定结果Figure 3. Determination results of organic acids with different extraction solvents由图3可知,以水和甲醇为萃取溶剂时,烟用香精香料中苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、己二酸、乙酰丙酸等有机酸的测定值基本相当,但水萃取所得丙二酸、琥珀酸和马来酸的测定值较高。考虑到甲醇萃取时苹果酸易出现峰分叉现象,试验选择水为萃取溶剂。
2.3.2 萃取方式和时间
以4个香精香料样品为待测对象,试验考察了超声萃取和振荡萃取两种方式下典型有机酸苹果酸、柠檬酸和乳酸的萃取效果,结果见图4。
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图 4 振荡萃取和超声萃取方式下典型有机酸的测定结果Figure 4. Determination results of typical organic acids by oscillation and ultrasonic extraction methods由图4可知,苹果酸、柠檬酸和乳酸在振荡和超声条件下的提取效果基本相当,但超声萃取所得测定值的标准偏差更小。因此,试验选择超声萃取方法进行样品前处理,并进一步比较了不同超声萃取时间（10,20,30,40 min）下上述3种有机酸的萃取效果。结果表明,3种有机酸的测定值在超声萃取时间不小于10 min时较高且基本不变,因此试验选择的超声萃取时间为10 min。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线、检出限和测定下限
用水稀释混合标准中间液配制混合标准溶液系列（浓度点见表2,为精确称样量下经纯度折算成的质量浓度）,并按照仪器工作条件测定,以目标有机酸的定量子离子峰面积为纵坐标,对应的质量浓度为横坐标进行回归分析,得到的9种有机酸的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。
表 2 线性参数、检出限和测定下限Table 2. Linearity parameters, detection limits and lower limits of determination有机酸 浓度点ρ/（mg·L−1） 线性范围ρ/（mg·L−1） 线性回归方程 相关系数 检出限ρ/（mg·L−1） 测定下限ρ/（mg·L−1） 苹果酸 0.059,0.119,0.238,0.594,1.19,2.38 0.059~2.38 y=1.852×107x−2.551×104 0.999 9 0.005 0.018 柠檬酸 0.054,0.107,0.215,0.537,1.07 0.054~1.07 y=8.477×106x−3.428×105 0.999 1 0.018 0.059 乳酸 0.043,0.086,0.172,0.431,0.86,1.72 0.043~1.72 y=4.173×106x+2.802×105 0.999 8 0.015 0.049 丙二酸 0.042,0.084,0.168,0.421,0.84,1.68 0.042~1.68 y=1.026×107x−1.001×105 0.999 9 0.006 0.020 琥珀酸 0.085,0.171,0.342,0.854,1.71 0.085~1.71 y=1.750×107x+1.106×105 1.000 0.004 0.013 马来酸 0.075,0.150,0.301,0.752,1.50 0.075~1.50 y=2.904×107x+1.022×106 0.999 1 0.005 0.015 酒石酸 0.047,0.095,0.189,0.473,0.95,1.89 0.047~1.89 y=6.171×106x−1.675×105 0.999 8 0.015 0.048 己二酸 0.050,0.100,0.199,0.498,1.00 0.050~1.00 y=1.522×107x+5.061×105 0.999 8 0.003 0.011 乙酰丙酸 0.053,0.106,0.213,0.531,1.06,2.13 0.053~2.13 y=2.270×106x+2.192×104 0.999 9 0.013 0.042 对最低浓度点的标准溶液连续进样10次,计算峰面积的标准偏差,以3倍、10倍标准偏差s和标准曲线斜率k的比值计算检出限（3s/k）和测定下限（10s/k）,结果见表2。
由表2可知,9种有机酸的检出限为0.003~0.018 mg·L−1,测定下限为0.011~0.059 mg·L−1。
2.4.2 精密度和回收试验
选取一个典型的烟用香精香料样品,按照试验方法进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次以考察方法的日内精密度,连续测定5 d（每天测定一次）以考察方法的日间精密度,结果均以测定值的相对标准偏差（RSD）表示,如表3所示。
表 3 精密度和回收试验结果Table 3. Results of tests for precision and recovery有机酸 加标量ρ/（mg·L−1） 回收率/% 日内RSD (n=6)/% 日间RSD (n=5)/% 有机酸 加标量ρ/（mg·L−1） 回收率/% 日内RSD (n=6)/% 日间RSD (n=5)/% 苹果酸 0.12 90.7 2.6 7.7 马来酸 0.15 73.3 10 14 0.24 90.0 2.6 6.7 0.30 82.4 8.9 13 1.19 87.4 1.8 3.6 1.50 83.1 3.3 7.1 柠檬酸 0.11 104 8.3 12 酒石酸 0.10 90.6 4.4 8.1 0.22 88.2 3.3 5.9 0.19 88.6 2.6 6.4 1.07 98.2 2.6 3.8 0.95 83.8 1.7 3.9 乳酸 0.09 83.1 7.5 8.5 己二酸 0.10 84.5 7.8 15 0.17 85.7 5.9 7.6 0.20 94.9 2.3 5.2 0.86 96.0 1.9 3.3 1.00 97.9 2.3 4.7 丙二酸 0.08 80.5 3.4 7.9 乙酰丙酸 0.11 112 4.3 13 0.17 88.7 3.9 5.7 0.21 98.5 4.3 11 0.84 87.3 1.7 2.9 1.06 107 2.9 4.7 琥珀酸 0.17 82.3 8.7 12 0.34 93.2 3.8 5.5 1.71 95.6 3.9 5.0 由表3可知,9种有机酸的回收率为73.3%~112%,方法的日内和日间精密度均较好,其中日内RSD为1.7%~10%,日间RSD为2.9%~15%,说明方法的准确度和精密度较好。
2.5 样品分析
2.5.1 定性
按照试验方法分析典型烟用香精香料样品中的9种有机酸,总离子流色谱图见图5。
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图 5 典型烟用香精香料样品的总离子流色谱图Figure 5. Total ion chromatogram of a typical tobacco flavor sample由图5可知,检出的各有机酸的峰形良好。本方法与传统MRM定性定量方法相比,增加了EPI二级质谱库辅助定性。以上述检出的苹果酸为例简述利用EPI二级质谱库进行辅助定性的基本步骤。将各有机酸标准溶液注入质谱仪,将得到的EPI二级质谱图（见图1）加入自建谱库,作为参比图,同时对实际样品EPI二级质谱信息（见图6）进行自动检索,得到样品溶液和标准溶液中苹果酸的匹配度达到94.22%,结合保留时间确认了目标物苹果酸。其他有机酸的定性步骤参照执行。
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图 6 样品溶液中苹果酸的EPI二级质谱图Figure 6. EPI secondary mass spectrum of malic acid in the sample solution2.5.2 定量
142种烟用香精香料样品中9种有机酸的检测结果见表4。
表 4 样品分析结果Table 4. Analytical results of the samples有机酸 检出率/% 检出量w/（mg·g−1） 检出均值w/（mg·g−1） 苹果酸 68 0.010~13.160 2.310 柠檬酸 44 0.104~81.287 5.777 乳酸 84 0.039~84.515 2.312 丙二酸 9 0.036~1.097 0.161 琥珀酸 61 0.008~0.885 0.110 马来酸 0 - - 酒石酸 23 0.032~3.920 0.340 己二酸 15 0.006~0.265 0.031 乙酰丙酸 37 0.026~0.679 0.158 由表4可知：乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等4种有机酸在142种香精香料样品中的检出率较高,马来酸未检出；苹果酸、柠檬酸、乳酸的检出均值较高。
本工作采用超声辅助萃取-液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法实现了烟用香精香料中9种有机酸的定性定量分析,方法定性准确,检出限低,精密度和准确度均较好,可为烟用香精香料中有机酸的检测提供方法参考。
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图 2 9种有机酸在不同色谱柱上的总离子流色谱图
Figure 2. Total ion chromatograms of 9 organic acids on the different chromatographic columns
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图 3 不同萃取溶剂下有机酸的测定结果
Figure 3. Determination results of organic acids with different extraction solvents
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图 4 振荡萃取和超声萃取方式下典型有机酸的测定结果
Figure 4. Determination results of typical organic acids by oscillation and ultrasonic extraction methods
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图 5 典型烟用香精香料样品的总离子流色谱图
Figure 5. Total ion chromatogram of a typical tobacco flavor sample
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图 6 样品溶液中苹果酸的EPI二级质谱图
Figure 6. EPI secondary mass spectrum of malic acid in the sample solution
表 1 质谱参数
Table 1 MS parameters
序号 有机酸 保留时间/min 母离子质荷比（m/z） 定量子离子m/z 去簇电压/V 碰撞能量/eV 1 酒石酸 5.46 148.3 86.9 -30 -16 2 苹果酸 6.52 132.8 114.9 -30 -15 3 丙二酸 6.90 102.8 58.9 -40 -14 4 乳酸 7.97 88.9 43.0 -40 -14 5 马来酸 8.95 114.8 70.9 -40 -14 6 柠檬酸 9.82 190.8 110.9 -35 -18 7 琥珀酸 11.71 116.8 72.9 -25 -14 8 乙酰丙酸 13.29 114.8 96.9 -30 -12 9 己二酸 15.08 144.9 82.9 -40 -16 
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表 2 线性参数、检出限和测定下限
Table 2 Linearity parameters, detection limits and lower limits of determination
有机酸 浓度点ρ/（mg·L−1） 线性范围ρ/（mg·L−1） 线性回归方程 相关系数 检出限ρ/（mg·L−1） 测定下限ρ/（mg·L−1） 苹果酸 0.059,0.119,0.238,0.594,1.19,2.38 0.059~2.38 y=1.852×107x−2.551×104 0.999 9 0.005 0.018 柠檬酸 0.054,0.107,0.215,0.537,1.07 0.054~1.07 y=8.477×106x−3.428×105 0.999 1 0.018 0.059 乳酸 0.043,0.086,0.172,0.431,0.86,1.72 0.043~1.72 y=4.173×106x+2.802×105 0.999 8 0.015 0.049 丙二酸 0.042,0.084,0.168,0.421,0.84,1.68 0.042~1.68 y=1.026×107x−1.001×105 0.999 9 0.006 0.020 琥珀酸 0.085,0.171,0.342,0.854,1.71 0.085~1.71 y=1.750×107x+1.106×105 1.000 0.004 0.013 马来酸 0.075,0.150,0.301,0.752,1.50 0.075~1.50 y=2.904×107x+1.022×106 0.999 1 0.005 0.015 酒石酸 0.047,0.095,0.189,0.473,0.95,1.89 0.047~1.89 y=6.171×106x−1.675×105 0.999 8 0.015 0.048 己二酸 0.050,0.100,0.199,0.498,1.00 0.050~1.00 y=1.522×107x+5.061×105 0.999 8 0.003 0.011 乙酰丙酸 0.053,0.106,0.213,0.531,1.06,2.13 0.053~2.13 y=2.270×106x+2.192×104 0.999 9 0.013 0.042
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表 3 精密度和回收试验结果
Table 3 Results of tests for precision and recovery
有机酸 加标量ρ/（mg·L−1） 回收率/% 日内RSD (n=6)/% 日间RSD (n=5)/% 有机酸 加标量ρ/（mg·L−1） 回收率/% 日内RSD (n=6)/% 日间RSD (n=5)/% 苹果酸 0.12 90.7 2.6 7.7 马来酸 0.15 73.3 10 14 0.24 90.0 2.6 6.7 0.30 82.4 8.9 13 1.19 87.4 1.8 3.6 1.50 83.1 3.3 7.1 柠檬酸 0.11 104 8.3 12 酒石酸 0.10 90.6 4.4 8.1 0.22 88.2 3.3 5.9 0.19 88.6 2.6 6.4 1.07 98.2 2.6 3.8 0.95 83.8 1.7 3.9 乳酸 0.09 83.1 7.5 8.5 己二酸 0.10 84.5 7.8 15 0.17 85.7 5.9 7.6 0.20 94.9 2.3 5.2 0.86 96.0 1.9 3.3 1.00 97.9 2.3 4.7 丙二酸 0.08 80.5 3.4 7.9 乙酰丙酸 0.11 112 4.3 13 0.17 88.7 3.9 5.7 0.21 98.5 4.3 11 0.84 87.3 1.7 2.9 1.06 107 2.9 4.7 琥珀酸 0.17 82.3 8.7 12 0.34 93.2 3.8 5.5 1.71 95.6 3.9 5.0
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表 4 样品分析结果
Table 4 Analytical results of the samples
有机酸 检出率/% 检出量w/（mg·g−1） 检出均值w/（mg·g−1） 苹果酸 68 0.010~13.160 2.310 柠檬酸 44 0.104~81.287 5.777 乳酸 84 0.039~84.515 2.312 丙二酸 9 0.036~1.097 0.161 琥珀酸 61 0.008~0.885 0.110 马来酸 0 - - 酒石酸 23 0.032~3.920 0.340 己二酸 15 0.006~0.265 0.031 乙酰丙酸 37 0.026~0.679 0.158
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