真菌是中药材中的主要污染源,真菌菌核会产生有毒次生代谢产物真菌毒素,威胁人类身体健康^[1-2]。黄曲霉毒素和赭曲霉毒素是由真菌黄曲霉、寄生曲霉、赭曲霉产生的代谢产物,是自然界中广泛存在的主要真菌毒素^[3-5],包括黄曲霉毒素B₁（AFB_l）、黄曲霉毒素B₂（AFB₂）、黄曲霉毒素G₁（AFG₁）、黄曲霉毒素G₂（AFG₂）和赭曲霉毒素A（OTA）等。作为新“浙八味”之一的衢枳壳是芸香科植物常山胡柚的干燥未成熟果实,含糖类、维生素、挥发油以及黄酮类等物质,道地产地在浙江衢州常山。衢州地区地势较低,周围环山,常年温湿气候,为产毒曲霉的生长提供了有利条件。如果采收、储藏、运输环境条件不当,衢枳壳会被多种产毒曲霉侵染,从而使其品质和安全性受到严重影响。因此,建立衢枳壳中AFB_l、AFB₂、AFG₁、AFG₂和OTA多残留的检测方法势在必行。

目前文献报道的真菌毒素的检测方法有酶联免疫吸附测定法^[6-8]、胶体金免疫层析法^[9-10]、薄层色谱法^[11-12]、高效液相色谱法^[13-15]和高效液相色谱-串联质谱法^[16-18]等,但是其检测对象不包括衢枳壳。常见的净化方法有免疫亲和柱和HLB固相萃取柱净化法。免疫亲和柱所用填料是根据毒素的化学结构免疫形成的蛋白质结构材料,其专一性强,回收效果稳定。因此,本工作采用黄曲霉毒素和赭曲霉毒素复合免疫亲和柱（简称“复合免疫亲和柱”）净化衢枳壳提取液,以超高效液相色谱-串联质谱法测定净化液中AFB_l、AFB₂、AFG₁、AFG₂和OTA的含量,可为衢枳壳中真菌毒素的检测提供科学的方法。

1.   试验部分

1.1   仪器与试剂

LC-20ADXR型超高效液相色谱仪；QTRAP 4000型串联质谱仪；XIR型台式冷冻离心机；SupelcoSPE-12型固相萃取装置；N-EVAP型氮吹仪；Milli-Q型超纯水仪；复合免疫亲和柱（3 mL/60 mg）；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)。

单标准溶液：AFB_l、AFB₂、AFG₁、AFG₂的质量浓度为25 mg·L⁻¹,OTA的质量浓度为50 mg·L⁻¹。

混合标准储备溶液：1 000 μg·L⁻¹,取25 mg·L⁻¹ AFB_l、AFB₂、AFG₁、AFG₂的单标准溶液1 mL和50 mg·L⁻¹ OTA单标准溶液0.5 mL置于25 mL容量瓶中,用乙腈稀释,摇匀备用。

单同位素内标溶液：¹³C₁₇-AFB_l、¹³C₁₇-AFB₂、¹³C₁₇-AFG_l、¹³C₁₇-AFG₂、¹³C₂₀-OTA的质量浓度为0.5 mg·L⁻¹。使用时用乙腈稀释至所需的质量浓度。

混合同位素内标溶液：50.00 μg·L⁻¹,取各真菌毒素的单同位素内标溶液各1 mL置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释,摇匀备用。

混合标准溶液系列：取适量混合标准储备溶液和混合同位素内标溶液,用80%（体积分数,下同）乙腈溶液稀释,配制成各真菌毒素的质量浓度为0.05,0.10,0.20,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00,20.00 μg·L⁻¹,其同位素内标的质量浓度均为0.20 μg·L⁻¹ 的混合标准溶液系列。

乙腈和甲醇为色谱纯；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾为分析纯；试验用水为一级水。

衢枳壳样品均为市售药材,经鉴定为芸香科植物常山胡柚的干燥未成熟果实的干燥物,无黄曲霉毒素、赭曲霉毒素污染,作为阴性样品装入塑料袋中密封,存储于阴凉避光处。

1.2   仪器工作条件

1.2.1   色谱条件

XDB C₁₈色谱柱（100 mm×3.0 mm,1.8 μm）；柱温40 ℃；进样体积10 μL；流动相A为体积比1∶9的甲醇-5 mmol·L⁻¹乙酸铵混合溶液,B为体积比9∶1甲醇-5 mmol·L⁻¹乙酸铵混合溶液；流量0.3 mL·min⁻¹。梯度洗脱程序：0~2.00 min,A由75%降至55%；2.00~10.00 min,A由55%降至10%；10.00~12.00 min,A由10%升至15%；12.00~12.01 min,A由15%跳转至75%,保持3.00 min。

1.2.2   质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子（ESI⁺）模式；离子源温度550 ℃；碰撞气模式为中等；雾化气压力413 kPa,辅助加热气压力413 kPa,气帘气压力207 kPa；喷雾电压5 500 V；多反应监测（MRM）模式。其他质谱参数见表1。

表  1  质谱参数

Table  1.  MS parameters

真菌毒素	保留时间/min	母离子质荷比（m/z）	子离子m/z		去簇电压/V	碰撞能量/eV
			定量	定性
AFBl	5.90	313.2	285.1	241.2	120	33, 50
13C17- AFBl	5.90	330.4	255.3		120	33
AFB2	5.51	315.5	259.2	287.5	113	39, 35
13C17-AFB2	5.50	332.5	303.4		113	28
AFG1	5.03	329.5	243.4	311.3	110	38, 30
13C17- AFG1	5.02	346.3	257.3		110	35
AFG2	4.62	331.5	245.2	313.5	120	41, 33
13C17- AFG2	4.64	348.5	259.4		120	44
OTA	6.61	404.1	239.4	358.3	80	32, 21
13C20-OTA	6.60	424.0	250.5		127	29

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1.3   试验方法

样品用高速粉碎机粉碎,混合均匀后过20目（孔径0.9 mm）筛。分取5 g样品粉末,加入100 μL 10.00 μg·L⁻¹混合同位素内标溶液和25 mL体积比79∶20∶1的乙腈-水-乙酸混合溶液,超声提取30 min,以10 000 r·min⁻¹ 转速离心5 min,上清液备用。

将复合免疫亲和柱放置至室温。取10 mL上清液,用70 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释,全部装载至固相萃取装置的针筒内,连通空气压力泵,调节压力使上述溶液以3 mL·min⁻¹流量缓缓通过复合免疫亲和柱。先用5 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液淋洗柱子,加压排尽柱中残留液体。分两次加入体积比98∶2的甲醇-乙酸混合溶液,每次均用1.0 mL,自然洗脱至干后,加压排净洗脱液。收集并合并洗脱液,过0.22 μm滤膜,滤液采用仪器工作条件测定。

2.   结果与讨论

2.1   提取溶剂的选择

结合5种真菌毒素的溶解性,试验选择了常用的甲醇和乙腈作提取溶剂,并在其中添加一定量水促进提取溶剂进入固体基质中,在乙腈溶液中加入一定量酸阻断真菌毒素与基质中糖和蛋白质的结合,比较了以70%（体积分数）甲醇溶液和体积比79∶20∶1的乙腈-水-乙酸混合溶液提取时阳性样品中5种真菌毒素的提取效果。结果显示：二者对于检出的AFB₁的回收率分别为91.7%和93.5%,说明后者的提取效果略优于前者的。因此,试验选择的提取溶剂为体积比79∶20∶1的乙腈-水-乙酸混合溶液。

2.2   净化柱的选择

HLB固相萃取柱适用范围广,但是针对性不强,同时在净化多残留样品时,由于该柱对各目标物保留强度差别较大,导致洗脱溶剂用量过大,需要采用氮吹等方法对洗脱溶液进行浓缩,操作繁琐且可能造成部分目标物损失。免疫亲和柱所用洗脱溶剂用量较少,无需对洗脱溶液进行浓缩操作,净化步骤更简单。另外,按照试验方法采用Oasis HLB固相萃取柱和复合免疫亲和柱净化加标样品,结果显示：以Oasis HLB固相萃取柱净化时,AFB_l、AFB₂、AFG₁、AFG₂和OTA的回收率分别为84.0%,86.5%,72.8%,77.3%,81.0%；以复合免疫亲和柱净化时,上述5种真菌毒素的回收率分别为90.3%,85.9%,91.5%,83.4%,84.8%,说明复合免疫亲和柱的回收效果优于Oasis HLB固相萃取柱的。因此,试验选择采用复合免疫亲和柱对实际样品进行净化。

2.3   色谱条件的选择

以甲醇作有机相时,黄曲霉毒素B、G族化合物能达到较好分离,且其离子化效率较高,因此试验选择甲醇作有机相。为避免ESI⁺扫描模式下出现黄曲霉毒素加钠或加钾离子峰的现象,试验选择在水相和流动相中添加少量的乙酸铵,但是乙酸铵的添加浓度不易过高,否则会抑制黄曲霉毒素的离子化,优化后的流动相体系见1.2节。在优化的色谱条件下,5种真菌毒素的总离子流色谱图如图1所示。

图  1  5种真菌毒素的总离子流色谱图

Figure  1.  Total ion chromatogram of the 5 mycotoxins

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2.4   质谱条件的选择

AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂含有羰基,易与H⁺结合形成[M+H] ⁺,适合采用ESI⁺扫描模式；OTA既含有羰基又含有羟基,正、负扫描模式均可选择。结合以上因素同时考虑到ESI⁺扫描模式下5种真菌毒素的离子丰度均较高,试验选择采用ESI⁺模式进行一级质谱扫描,得到各真菌毒素的母离子。对母离子进行二级质谱扫描,选择响应较强的子离子作定量、定性离子,同时优化去簇电压、碰撞能量等参数,优化的结果见表1。

5种真菌毒素及其同位素内标的MRM色谱图见图2。

图  2  5种真菌毒素及其同位素内标的MRM色谱图

Figure  2.  MRM chromatograms of the 5 mycotoxins and their isotopic internal standards

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2.5   基质效应

考虑到中药材基质复杂,基质效应影响较大,试验配制了基质匹配后、前标准溶液系列,按照仪器工作条件分别测定,并绘制工作曲线和标准曲线,以二者斜率比和1差值的百分数来计算基质效应值。结果显示：AFB₂、AFG₁、AFG₂和OTA的基质效应值绝对值均小于9.5%,而AFB₁的基质效应值为−42.2%,基质抑制效应显著。因此,试验采用每种真菌毒素对应的碳同位素化合物作为内标,并对其质谱参数进行了优化,以消除基质效应的影响。

2.6   标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各真菌毒素与其同位素内标的质量浓度比为横坐标,其对应的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线,所得线性参数见表2。

表  2  5种真菌毒素的线性参数和检出限

Table  2.  Linearity parameters and detection limits of the 5 mycotoxins

真菌毒素	线性范围ρ/(μg·L−1)	线性回归方程	相关系数	检出限w/(μg·kg−1)
AFB1	0.05~20.00	y=3.434×105x+2.640×103	0.999 5	0.05
AFB2	0.10~20.00	y=2.060×104x+7.070	0.999 5	0.10
AFG1	0.10~20.00	y=1.172×104x+1.031×102	0.999 4	0.10
AFG2	0.20~20.00	y=8.331×103x+7.530×10	0.999 6	0.20
OTA	0.10~20.00	y=2.240×103x+8.580×102	0.999 6	0.10

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对阴性加标样品进行分析,以明显大于3倍信噪比的加标量计算检出限,所得结果见表2。

2.7   精密度和回收试验

按照试验方法对阴性衢枳壳样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平重复分析6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD）,结果见表3。

真菌毒素	加标量w/(μg·kg−1)	回收率/%	RSD/%
AFB1	0.05	84.4	6.3
	0.50	83.6	6.9
	5.00	88.5	5.2
AFB2	0.10	87.3	7.9
	0.50	90.2	6.4
	5.00	91.1	6.7
AFG1	0.10	83.6	9.4
	0.50	82.7	8.6
	5.00	85.9	5.3
AFG2	0.20	85.6	12
	0.50	86.7	8.5
	5.00	86.0	7.2
OTA	0.10	97.3	7.2
	0.50	94.1	6.2
	5.00	92.8	6.8

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由表3可知,5种真菌毒素的回收率为82.7%~97.3%,测定值的RSD为5.2%~12%,符合SN/T 0001—2016 《出口食品、化妆品理化测定方法标准编写的基本规定》的相关要求。

本工作采用复合免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定衢枳壳中AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂和OTA含量的方法。该方法一次性完成提取、净化和测定等操作,具有高效、简便、专一性强等特点,准确度和精密度满足检测要求,可为衢枳壳中多种真菌毒素的监管提供有力的技术支撑。